背景
目前研究报道过敏患者食用鱼中原肌球蛋白会表现出一些临床症状。然而，关于鱼、虾、贝中原肌球蛋白之间的交叉反应以及加热过程中蛋白结构变化的相关研究较少。
方法
本文研究发明了一种非热提取原肌球蛋白的方法，并对比分析了加热和非加热原肌球蛋白IgG/IgE结合能力，交叉反应以及结构的变化。
结果
1、建立非热提取鱼-TM，虾-TM和贝-TM的方法
通过硫酸铵沉淀和等电点沉淀的方法进行非热提取TM，其主要步骤如图A，其中图B，C，D分别表示鱼-TM，虾-TM和贝-TM在提取过程中的主要过程。整个提取过程在低温进行，电泳结果表明TM的分子质量为35kDa左右，显示有单一明显的条带，其蛋白纯度在90%以上。提纯的蛋白通过MALDI-TOF-MS进行鉴定，并与NCBI数据库进行比对分析，确认提纯的蛋白分别为鱼-TM，虾-TM和贝-TM。本方法方便操作，不需要经过离子交换着进行处理，因此可以提取较多的蛋白，g肌肉中大概可以获取20mg的原肌球蛋白。
2、SDS-PAGE和Westernblot分析加热、非加热TM
通过SDS-PAGE分析，鱼-TM，虾-TM和贝-TM的纯度在90%以上（上样量为1.5ug），分子质量在35kDa左右（图A）。此外，加热和非加热TM之间没有明显差异。IgG免疫分析表明：贝-TM被虾-IgG多抗识别率大于60%，鱼-TM几乎不被虾-IgG多抗识别，表明贝-TM和虾-TM之间有明显的交叉反应和相似的表位。IgG免疫分析结果表明加热和非加热TM之间没有显著性差异。
3、加热和非加热TM的IgG-IgE结合能力分析
本文收集了15例虾过敏患者的血液，其中8例男性，7例女性，年龄在3-62之间，虾特异性IgE范围是0.58-2.71kUA/L。采用ELISA方法检测鱼-TM，虾-TM，贝-TM与其IgE结合的能力。与虾-TM相比，贝-TM的结合率在50-70%之间，虾-TM只有20-30%的结合率。此外，当血清特异性IgE范围在0.58-2.71kUA/L之间时，虾-TM和贝-TM表现出较强的结合能力，其中鱼-TM，虾-TM和贝-TM的吸光度（nm）分别为0.21-0.49，0.21-1.43和0.21-1.37（图A）。
采用间接ELISA和抑制性ELISA分析加热和非加热TM的IgG/IgE结合能力。在IgG结合能力方面，间接ELISA表明:非热和加热虾-TM的吸光度分别为1.43和1.40，贝-TM的吸光度分别为0.8和1.16，其中加热和非加热TM之间没有显著性差异。鱼-TM的IgG结合率为虾-TM的70%（图B）。抑制性ELISA表明：在虾-TM和贝-TM浓度为0.ug/mL-1ug/mL时，IgG抑制率有显著性变化，鱼-TM的IgG抑制率变化趋势较小。加热、非加热虾-TM的最大抑制率分别为72.2和76.3%，加热、非加热贝-TM的最大抑制率分别为71.3和74.1%（图D）。在IgE结合能力方面，间接ELISA表明:加热和非加热的虾-TM没有显著性差异，与阴性对照相比，贝-TM与虾-TM的结合能力较为相似（图C）。抑制性ELISA表明：鱼-TM，虾-TM和贝-TM的最大抑制率分别为24.4%（rawfish）,21.9%（boiledfish），65.5%（rawshrimp），66.1%（boiledshrimp），63.9%（rawclam）和61.4%（boiledclam）。虾-TM和贝-TM之间的交叉反应率分别为97.6%（rawTM）和92.9%（boiledTM）。
4、加热和非加热TM之间的结构分析
分别通过圆二色谱，紫外光谱，内源荧光谱和表面疏水性分析加热和非加热TM的结构。圆二色谱结果表明：TM具有典型的a-螺旋二级结构，其中加热和非加热蛋白在a-螺旋，β-折叠，β-转角和无规则卷曲方面没有明显差异（图A）。紫外光谱表明：加热和非加热鱼-TM，虾-TM和贝-TM的最大吸收峰分别为.5nm/.5nm，.0nm/.5nm和.5nm/.5nm，（图B和图C）。内源荧光光谱表明：加热和非加热鱼-TM，虾-TM和贝-TM的最大吸收峰分别为.6nm/.2nm，.2nm/.6nm和.0nm/.8nm，加热TM最大吸收峰仅有轻微蓝移现象（图D）。表面疏水性结果表明：鱼-TM的表面疏水性为.1，分别为虾-TM（.8）和贝-TM（.0）的2.63倍和1.71倍（图E），此外，与加热TM相比，非加热TM的表面疏水性结果显著性增高，其中鱼-TM，虾-TM和贝-TM的疏水性分别下降了80.0,21.4和59.2%，表明在加热过程中蛋白结构和过敏表位发生变化。
结论
结论：本文建立了一种非加热提取鱼-TM，虾-TM和贝-TM的方法，并分析比较了其IgG/IgE结合能力和蛋白结构的变化。不同来源和质量的虾过敏患者血清结果表明，与虾-TM和贝-TM相比，鱼-TM的IgE结合率为30-35%。虾-TM和贝-TM之间的交叉反应较强，存在相似的过敏表位。此外，加热和非加热TM在IgG/IgE结合能力和蛋白结构方面没有显著变化。
文献信息
LiLi,X.,Hong,L.,ZhenXing,L.,Ishfaq,A.,Pramod,S.N.,Hang,L.,LiangTao,L.,ShengLan,T.,ZhiWen,Y.().Influenceofnonthermalextractiontechniqueandallergenicitycharacteristicsoftropomyosinfromfish(Larimichthyscrocea)in白癜风涂什么药专家白癜风
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